DNA- Replikation
Der semikonservative Mechanismus der DNA-Replikation war bereits von den Forschern James Watson und Francis Crick vorgeschlagen worden, aber erst Matthew Meselson und Franklin Stahl haben diese Hypothese auch experimentell bestätigt.
Ablauf der DNA-Replikation
In der Abbildung zeigt ein Schema die DNA-Replikation. Generell läuft der Replikationsprozess in folgender Weise ab:
Um das Ablesen der innenliegenden Basen überhaupt zu ermöglichen, muss der DNA-Strang zuerst geöffnet werden. Enzym: Helikase.
Die DNA-Polymerase III (und auch andere DNA-Polymerasen) ist nur aktiv, wenn ein freies 3'-OH zur Verfügung steht. Da dies zu Beginn der DNA-Replikation nicht der Fall ist, muss ein Starter- oder Helfermolekül (= Primer) bereitgestellt werden. Dies ist der DNA-Primer, ein kurzes Stück komplementärer RNA-Nukleotide, die an den DNA-Strang binden und das benötigte 3'-OH beinhalten. Das Primer-produzierende Enzym wird als Primase bezeichnet und ist eine RNA-Polymerase. Dieses RNA- oder Primermaterial muss aus dem replizierten DNA-Strang entfernt werden!
Beide Stränge dienen als Vorlage bei der Vervielfältigung der DNA.
Beteiligt sind die Enzyme Helikase, Primase, DNA-Polymerase I & III sowie die DNA-Ligase. Die DNA-Polymerase ist ein riesiger Proteinkomplex aus 10 Proteinuntereinheiten (E. coli), der exakt Nukleotid für Nukleotid als komplementäre Kopie am neu entstehenden Strang anbaut. Leitstrang (leading strand) und Folgestrang (lagging strand) werden nach unterschiedlichen Mechanismen vervielfältigt.
Strangtrennung erfolgt durch die Helikase, Elongation mithilfe der Polymerase III (arbeitet auf Einzelstrang nur in 5’-3’-Richtung), Starthilfe durch das Enzym Primase, welches die Primer bildet.Die Polymerase I entfernt die RNA-Primer und ersetzt sie durch DNA-Nukleotide, die Lücken in der neuen DNA schließt die DNA-Ligase. Der Mechanismus ist leading- bzw. lagging-strand angepasst!
Methode
Betrachten Sie nochmals die Struktur des Nukleotids!
Welche C-Atome der Desoxyribose haben wichtige Aufgaben?
Replikation: Beide antiparallelen Stränge spielen eine wichtige Rolle!
Beginnen wir mit der Betrachtung des Leitstranges (leading strand): Am geöffneten Strang wird auf der 3'-5'-Seite ein komplementärer Primer angebracht. Dieser wird nun von der DNA-Polymerase III verlängert. Arbeitsrichtung ist immer von 5' nach 3', sodass die freie OH-Gruppe das Ende dieser Nukleotidkette bildet.
Der komplementäre Tochterstrang kann fortlaufend oder kontinuierlich gebildet werden. Am Ende der Replikation muss die Primersequenz entfernt werden (vgl. Bemerkungen zum Folgestrang).
Am Folgestrang (lagging strand) sind identische Vorgänge zu beobachten. Auch hier wird eine Primersequenz eingebaut, die DNA-Polymerase III baut Nukleotide in 5'-3'-Richtung ein. Allerdings orientiert sich der Folgestrang entgegen der Arbeitsrichtung der Helikase: Der DNA-Strang wird entgegengesetzt der Arbeitsrichtung auf dem Folgestrang geöffnet. Um ein „Auseinanderlaufen der DNA-Replikation“ zu verhindern, wird in der DNA-Polymerase der Folgestrang zu einer Schleife gedreht! So folgt die „gedrehte Arbeitsrichtung“ nun dem Aufspaltungsprozess der Helikase.
Das Problem: Die DNA-Schlaufen sind relativ kurz, sodass auf dem Folgestrang sehr viele Primer (im Prinzip einer pro gelegter Schlaufe) benötigt werden. Die im Verhältnis zum Leitstrang entstehenden kurzen Stücke des neu gebildeten DNA-Doppelstrangs werden Okazaki-Fragmente genannt.
Das Enzym legt den DNA-Folgestrang in eine Schlaufe. Dies ermöglicht ihr, die Replikationsrichtung in eine Gesamtrichtung fortzuführen, obwohl die beiden DNA-Stränge antiparallel verlaufen. Auf dem Folgestrang entstehen dabei die Okazaki-Fragmente.
Die Primer müssen nun auf Leit- und Folgestrang entfernt werden, sodass am Ende der DNA-Replikation zwei exakte Kopien der verdoppelten DNA vorliegen. Den Abbau der RNA-Primer übernimmt die DNA-Polymerase I. Diese entfernt die RNA-Nukleotide und ersetzt sie durch DNA-Nukleotide.
Die Substrate der DNA-Polymerase I sind identisch mit denen der DNA-Polymerase III: In beiden Fällen handelt es sich um DNA-Nukleotide. Ist die DNA-Polymerase I am Ende einer zu ersetzenden Primersequenz angelangt, dann hat hier die DNA-Polymerase III bereits ein DNA-Nukleotid eingebaut.
Das Ende der ersetzten Primersequenz (3'-OH) muss nun mit dem 5'-Phosphat des nächsten Nukleotids verbunden werden. Dies übernimmt das Enzym DNA-Ligase. Seine Aufgabe ist die Ausbildung der Phosphoesterbindung.
Jedes Mal, wenn sich eine Zelle teilt, muss das komplette genetische Material, die DNA, verdoppelt bzw. repliziert werden. Dafür sind die DNA-Polymerasen und alle oben genannten Enzyme zuständig.
Zusammenfassend sind alle an der Replikation beteiligten Enzyme in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Enzym | Funktion |
DNA-Helikase | Öffnen des DNA-Doppelstranges |
Primase (= eine RNA-Polymerase) | Erzeugen des Primer-Moleküls
|
DNA-Polymerase III | Verlängern des neuen (zur Vorlage komplementären) DNA-Stranges
|
DNA-Polymerase I | Entfernen der Primer-Nukleotide Ersetzen mit DNA-Nukleotiden |
DNA-Ligase | Ausbilden der Phosphoesterbindung zwischen dem zuletzt eingebauten DNA-Nukleotid und dem ersten bereits im neuen Strang vorhandenen Nukleotid |
Merke
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht es, einen Abschnitt der DNA in kurzer Zeit millionenfach zu vervielfältigen. Der Biochemiker Kary Banks Mullis wurde für ihre Entwicklung 1993 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. (Siehe dazu Methode PCR!)
Die Methode der PCR kopiert die Prozesse der DNA-Replikation "im Reagenzglas".
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