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Ausgehend von der DNA-Replikation in der Zelle, entwickelte Kary Bank Mullis ein Verfahren, das DNA im Reagenzglas (in vitro) durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mithilfe des Enzyms DNA-Polymerase vervielfältigt.

Die DNA-Polymerase bindet sich an den DNA-Strang und erzeugt einen dazu komplementären Strang (= DNA-Replikation). In der PCR ist die DNA-Polymerase das einzige verwendete Enzym, alle anderen Schritte können ohne enzymatische Hilfe im Reagenzglas umgesetzt werden.

Ablauf der PCR. DNA kann in vitro milliardenfach vervielfältigt werden.
Ablauf der PCR. DNA kann in vitro milliardenfach vervielfältigt werden.

Merke

Schritte der PCR: Denaturierung  -> Primer-Annealing -> Primer-Extension -> Denaturierung...

Tabelle: Vergleich DNA-Replikation vs. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Reaktionsschritt

DNA-Replikation (in vivo = in der Zelle; Bsp.: E.-coli-Bakterien)

PCR (in vitro = im Reagenzglas)

Öffnen des DNA-Doppelstranges

DNA-Helikase

Denaturierung:

Erhitzen der DNA auf 95 °C öffnet die Wasserstoffbrückenbindungen und führt zu Einzelsträngen

Startermolekül erzeugen

Primase (entspricht einer RNA-Polymerase); Primermaterial ist aus RNA-Nukleotiden gebildet!

Primer-Annealing:

Durch organische Synthese hergestellte Oligonukleotide (= DNA-Primer) von ca. 20 Basen Länge werden im PCR-Mix zugesetzt. Dabei wird in der Regel ein Paar unterschiedlicher Primer eingesetzt. Primer sind ca. 20 Basenpaare lang.

Voraussetzung: DNA-Sequenz der eingesetzten Primer muss komplementär zum zu vervielfältigenden Strang sein.

Vorteil: DNA-Nukleotide müssen nicht aus dem neu synthetisierten Strang entfernt werden!

Elongation
(= Einbau der Nukleotide)

DNA-Polymerase III übernimmt den Einbau von Nukleotiden in den beiden neu zu bildenden Strängen

Primer-Extension oder Elongation:

Eine DNA-Polymerase (in der Regel: Taq*-Polymerase) wird im Reagenzglas eingesetzt.

Vorteil des Enzyms aus *Thermus aquaticus: es ist hitzestabil und übersteht die 95 °C Denaturierungsphase.

Entfernen der RNA-Primer

DNA-Polymerase I entfernt RNA-Nukleotide und ersetzt sie durch DNA-Material

Nicht notwendig, da Primer selbst DNA-Material!

Lückenschluss

DNA-Ligase schließt letzte verbleibende Lücke zwischen dem 5’-Phosphat des bereits im Strang eingebauten n+1-Nukleotid und der OH-Gruppe des „letzten“ von der DNA-Polymerase I eingesetzten Nukleotids.

nicht notwendig

Video: Methode: Polymerase-Ketten-Reaktion

PCR oder Polymerase-Ketten-Reaktion entspricht der Vervielfältigung von DNA im Reagenzglas (in vitro) durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase.

Welcher DNA-Abschnitt durch PCR vermehrt wird, wird durch das experimentelle Design bestimmt, indem der gewünschte Bereich durch „Primer" eingegrenzt wird. Die folgende Abbildung erläutert dies.

Produkte der PCR. Gezeigt sind die Replikationsvorgänge der ersten drei Runden. Es werden insegsamt 30 - 45 PCR-Runden durchgeführt!

Produkte der PCR. Gezeigt sind die Replikationsvorgänge der ersten drei Runden. Es werden insgesamt 30–45 PCR-Runden durchgeführt! In jeder weiteren Runde liegen mehr „kurze" Templatestränge vor. Das Endprodukt der PCR entspricht dem kurzen, von den Primersequenzen flankierten DNA-Stück.

Die PCR wird in Thermozyklern durchgeführt, die in Sekundenschnelle auf die geforderte Temperatur des nächsten Zyklusschrittes aufgeheizt werden können. Hier gezeigt ein Cykler der Firma Biometra. Rechts in der Abbildung: Einblick ins Forschungslabor: Lagerung der PCR-Proben im Eisbad.
Die PCR wird in Thermozyklern durchgeführt, die in Sekundenschnelle auf die geforderte Temperatur des nächsten Zyklusschrittes aufgeheizt werden können. Hier gezeigt ein Cykler der Firma Biometra. Rechts in der Abbildung: Einblick ins Forschungslabor: Lagerung der PCR-Proben im Eisbad.

Die PCR - Revolution der Molekulargenetik

Zum Beispiel kann in der medizinischen Diagnostik mithilfe der PCR schnell und sicher eine Infektion durch Viren, Bakterien, Pilze oder Einzeller nachgewiesen werden, sofern Bereiche ihrer Erbsubstanz bekannt sind.

Da die PCR höchst sensitiv und schnell ist, kann z. B. das AIDS-Virus nachgewiesen werden, lange bevor ein immunologischer Nachweis möglich ist. 

Auch in der Grundlagenforschung spielt die Polymerase-Kettenreaktion eine dominierende Rolle, sei es bei der Sequenzanalyse, der gezielten oder zufälligen Mutagenese oder sei es bei der zellunabhängigen Klonierung.

Sehr bekannt wurde die PCR durch die Analyse menschlicher DNA. Durch gezieltes Vermehren von DNA-Abschnitten, die von Mensch zu Mensch verschieden lang sein können, erhält man bei der anschließenden Gelelektrophorese bestimmte Muster, vergleichbar mit einem Strichcode. In der Kriminalbiologie können so Täter, die Zellmaterial am Tatort hinterlassen haben (Hautabschürfungen, Haarwurzeln, Blut ...) identifiziert werden. Das DNA-Bandenmuster aus PCR und Restriktionsschnitten ist für jede Person so spezifisch wie ihr Fingerabdruck. In Analogie dazu nennt man dieses Verfahren „genetic fingerprinting".

Nach dem gleichen Prinzip werden Verwandtschaftsbeziehungen geklärt. Werden Bestandteile der Nahrung oder Kleidung auf die biologische Herkunft hin untersucht, bedient man sich ebenfalls der PCR.

Multiple-Choice
Der Entwickler der PCR war....
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Kommentare zum Thema: Methode: Polymerase-Ketten-Reaktion

  • Filiz schrieb am 13.12.2014 um 18:57 Uhr
    Super gut erklärt !
Bild von Autor Dr. Martina Henn-Sax

Autor: Dr. Martina Henn-Sax

Dieses Dokument Methode: Polymerase-Ketten-Reaktion ist Teil eines interaktiven Online-Kurses zum Thema Molekularbiologie / Genetik.

Dr. Martina Henn-Sax verfügt über langjährige Erfahrung auf diesem Themengebiet.
Vorstellung des Online-Kurses Molekularbiologie / GenetikMolekularbiologie / Genetik
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Molekularbiologie / Genetik

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