Methode: Polymerase-Ketten-Reaktion
Ausgehend von der DNA-Replikation in der Zelle, entwickelte Kary Bank Mullis ein Verfahren, das DNA im Reagenzglas (in vitro) durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mithilfe des Enzyms DNA-Polymerase vervielfältigt.
Die DNA-Polymerase bindet sich an den DNA-Strang und erzeugt einen dazu komplementären Strang (= DNA-Replikation). In der PCR ist die DNA-Polymerase das einzige verwendete Enzym, alle anderen Schritte können ohne enzymatische Hilfe im Reagenzglas umgesetzt werden.
Merke
Schritte der PCR: Denaturierung -> Primer-Annealing -> Primer-Extension -> Denaturierung...
Tabelle: Vergleich DNA-Replikation vs. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Reaktionsschritt | DNA-Replikation (in vivo = in der Zelle; Bsp.: E.-coli-Bakterien) | PCR (in vitro = im Reagenzglas) |
Öffnen des DNA-Doppelstranges | DNA-Helikase | Denaturierung: Erhitzen der DNA auf 95 °C öffnet die Wasserstoffbrückenbindungen und führt zu Einzelsträngen |
Startermolekül erzeugen | Primase (entspricht einer RNA-Polymerase); Primermaterial ist aus RNA-Nukleotiden gebildet! | Primer-Annealing: Durch organische Synthese hergestellte Oligonukleotide (= DNA-Primer) von ca. 20 Basen Länge werden im PCR-Mix zugesetzt. Dabei wird in der Regel ein Paar unterschiedlicher Primer eingesetzt. Primer sind ca. 20 Basenpaare lang. Voraussetzung: DNA-Sequenz der eingesetzten Primer muss komplementär zum zu vervielfältigenden Strang sein. Vorteil: DNA-Nukleotide müssen nicht aus dem neu synthetisierten Strang entfernt werden! |
Elongation | DNA-Polymerase III übernimmt den Einbau von Nukleotiden in den beiden neu zu bildenden Strängen | Primer-Extension oder Elongation: Eine DNA-Polymerase (in der Regel: Taq*-Polymerase) wird im Reagenzglas eingesetzt. Vorteil des Enzyms aus *Thermus aquaticus: es ist hitzestabil und übersteht die 95 °C Denaturierungsphase. |
Entfernen der RNA-Primer | DNA-Polymerase I entfernt RNA-Nukleotide und ersetzt sie durch DNA-Material | Nicht notwendig, da Primer selbst DNA-Material! |
Lückenschluss | DNA-Ligase schließt letzte verbleibende Lücke zwischen dem 5’-Phosphat des bereits im Strang eingebauten n+1-Nukleotid und der OH-Gruppe des „letzten“ von der DNA-Polymerase I eingesetzten Nukleotids. | nicht notwendig |
Welcher DNA-Abschnitt durch PCR vermehrt wird, wird durch das experimentelle Design bestimmt, indem der gewünschte Bereich durch „Primer" eingegrenzt wird. Die folgende Abbildung erläutert dies.
Die PCR - Revolution der Molekulargenetik
Zum Beispiel kann in der medizinischen Diagnostik mithilfe der PCR schnell und sicher eine Infektion durch Viren, Bakterien, Pilze oder Einzeller nachgewiesen werden, sofern Bereiche ihrer Erbsubstanz bekannt sind.
Da die PCR höchst sensitiv und schnell ist, kann z. B. das AIDS-Virus nachgewiesen werden, lange bevor ein immunologischer Nachweis möglich ist.
Auch in der Grundlagenforschung spielt die Polymerase-Kettenreaktion eine dominierende Rolle, sei es bei der Sequenzanalyse, der gezielten oder zufälligen Mutagenese oder sei es bei der zellunabhängigen Klonierung.
Sehr bekannt wurde die PCR durch die Analyse menschlicher DNA. Durch gezieltes Vermehren von DNA-Abschnitten, die von Mensch zu Mensch verschieden lang sein können, erhält man bei der anschließenden Gelelektrophorese bestimmte Muster, vergleichbar mit einem Strichcode. In der Kriminalbiologie können so Täter, die Zellmaterial am Tatort hinterlassen haben (Hautabschürfungen, Haarwurzeln, Blut ...) identifiziert werden. Das DNA-Bandenmuster aus PCR und Restriktionsschnitten ist für jede Person so spezifisch wie ihr Fingerabdruck. In Analogie dazu nennt man dieses Verfahren „genetic fingerprinting".
Nach dem gleichen Prinzip werden Verwandtschaftsbeziehungen geklärt. Werden Bestandteile der Nahrung oder Kleidung auf die biologische Herkunft hin untersucht, bedient man sich ebenfalls der PCR.
Weitere interessante Inhalte zum Thema
-
Lösungsvorschlag #6: Autoimmunreaktion
Vielleicht ist für Sie auch das Thema Lösungsvorschlag #6: Autoimmunreaktion (Abituraufgabe: Multiple Sklerose - Zytologie, Neurobiologie & Immunologie) aus unserem Online-Kurs Besprechung einer Original-Abituraufgabe - Multiple Sklerose (Zytologie/Neurobiologie/Immunologie) interessant.
-
Denaturierung
Vielleicht ist für Sie auch das Thema Denaturierung (Kinetik: rund um die Reaktionsgeschwindigkeit) aus unserem Online-Kurs Physikalische Chemie interessant.
zum Kurs 
