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Merke

cDNA steht für complementary DNA oder komplementäre DNA.

Wann wird cDNA wichtig?

Der genetische Code ist universell. Das ist korrekt. Die Codone des genetischen Codes sind in allen Lebewesen im Einsatz. Die Tabelle hat Gültigkeit für alle Organismen. Gleichwohl gibt es Schwierigkeiten, sobald man ein eukaryotisches Gen (z.B. ein Gen des Menschen) in Bakterien klonieren möchte um das humane Protein dort erzeugen zu lassen.

Diese Anwendung ist z.B. bei der Erzeugung von humanem Insulin von äußerster Wichtigkeit.

Gene von Eukaryoten und Prokaryoten - gleiches System aber komplexe Kommunikation

Wenn Sie an die Kapitel zur Proteinexpression zurückdenken, dann werden Sie sich schnell wieder die unterschiedliche Struktur der eukaryotischen Gene ins Gedächtnis zurückrufen.

Methode

Wiederholen Sie die Grundlagen der Proteinbiosynthese. Wo zeigen sich Unterschiede zwischen Eukaryoten und Prokaryoten?

Richtig!  Hier finden sich Exon-Intron-Strukturen. Die codierenden Regionen sind als Exons bezeichnet, die nicht codierenden Regionen werden Introns genannt. Exon und Intron sind innerhalb eines Gens vorhanden. Die Sequenz eines Gens kann sich in mehrere Exonregionen, die von Introns unterteilt werden, verteilt sein.

Bakterien verstehen keine Introns

Bakterien besitzen keine Intronstrukturen. Ein Gen wird hier durch eine fortlaufende nicht unterbrochene Sequenz codiert. Bakterien "verstehen" die Intron-Information nicht. Sie haben auch keine Möglichkeit die unreife mRNA zu spleißen oder sonst zu bearbeiten.

Rückschluss: soll ein Gen aus dem menschlichen Erbgut in E. coli kloniert werden, so geht dies nur, wenn die Exon-Intron-Struktur zuvor entfernt wurde.

Vorgehen:

  • humanes Gen wird transkribiert
  • unreife mRNA enthält Exon und Intron
  • Spleißen
  • reife mRNA enthält nur noch codierende (Exon-)Sequenz
  • Rückübersetzen der mRNA in DNA mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase
  • Produkt: cDNA
  • cDNA kann kloniert werden
  • diese Sequenzinformation kann in Bakterien transkribiert und translatiert werden
  • das humane Protein kann in Bakterienzellen erzeugt werden

Beispiel: Herstellung von humanem Insulin

Insulin ist das Medikament zur Behandlung von Diabetes-Patienten.

Das Insulin wird durch rekombinante Proteinexpression in E. coli gewonnen. Das heißt E. coli stellt ein Protein her, das nicht zu seinem eigenem Genom gehört. Daher der Begriff "rekombinant".

Insulin besteht aus drei Peptiden, die gemeinsam das wirksame Insulin bilden. Das A-, B-, und C-Peptid sind auf unterschiedlichen Exonsequenzen codiert. Dabei muss nun berücksichtig werden dass Bakterien keine Intronsequenz ausschneiden können.

Die drei Peptide ordnen sich als Insulinstruktur an, Disulfidbrücken werden gebildet,dann wird das C-Peptid (posttranslational) aus dem Insulin ausgeschnitten. Erst dann ist das Peptidhormon funktionell!

Herstellung von Insulin in E. coli

1. Schritt:

cDNA der Insulin-Peptide erzeugen. Hier reichen uns die cDNA von Peptid A und B, da das C-Peptid im funktionellen Insulin nicht mehr vorkommt.

2. Schritt:

Klonieren der DNA-Sequenzen der A- und B-Peptide in E.coli (jeweils ein Vektor für ein Peptid).

3. Schritt:

Transformation von E. coli Bakterien mit den jeweiligen Vektoren (A- oder B-Vektor)

4. Schritt:

Expression von A- bzw. B-Peptid in den Bakterien

5. Schritt:

Lyse der Bakterien, aufreinigen der Peptide (separat)

6. Schritt

Mischen des A- und B-Peptid unter "Disulfid-Brücken-bildenden" Bedingungen. Insulineinheiten finden sich zum funktionellen Insulin zusammen!

Lückentext
Bitte die Lücken im Text sinnvoll ausfüllen.
Zur Erzeugung von cDNA wird das Enzym eingesetzt.
0/0
Lösen

Hinweis:

Bitte füllen Sie alle Lücken im Text aus. Möglicherweise sind mehrere Lösungen für eine Lücke möglich. In diesem Fall tragen Sie bitte nur eine Lösung ein.

Bild von Autor Dr. Martina Henn-Sax

Autor: Dr. Martina Henn-Sax

Dieses Dokument cDNA ist Teil eines interaktiven Online-Kurses zum Thema Molekularbiologie / Genetik.

Dr. Martina Henn-Sax verfügt über langjährige Erfahrung auf diesem Themengebiet.
Vorstellung des Online-Kurses Molekularbiologie / GenetikMolekularbiologie / Genetik
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Molekularbiologie / Genetik

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