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cDNA

Methoden der Gen- und Reproduktionstechnik / Klonierung

Merke

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cDNA steht für complementary DNA oder komplementäre DNA.

Wann wird cDNA wichtig?

Der genetische Code ist universell. Das ist korrekt. Die Codone des genetischen Codes sind in allen Lebewesen im Einsatz. Die Tabelle hat Gültigkeit für alle Organismen. Gleichwohl gibt es Schwierigkeiten, sobald man ein eukaryotisches Gen (z.B. ein Gen des Menschen) in Bakterien klonieren möchte um das humane Protein dort erzeugen zu lassen.

Diese Anwendung ist z.B. bei der Erzeugung von humanem Insulin von äußerster Wichtigkeit.

Gene von Eukaryoten und Prokaryoten - gleiches System aber komplexe Kommunikation

Wenn Sie an die Kapitel zur Proteinexpression zurückdenken, dann werden Sie sich schnell wieder die unterschiedliche Struktur der eukaryotischen Gene ins Gedächtnis zurückrufen.

Methode

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Wiederholen Sie die Grundlagen der Proteinbiosynthese. Wo zeigen sich Unterschiede zwischen Eukaryoten und Prokaryoten?

Richtig!  Hier finden sich Exon-Intron-Strukturen. Die codierenden Regionen sind als Exons bezeichnet, die nicht codierenden Regionen werden Introns genannt. Exon und Intron sind innerhalb eines Gens vorhanden. Die Sequenz eines Gens kann sich in mehrere Exonregionen, die von Introns unterteilt werden, verteilt sein.

Bakterien verstehen keine Introns

Bakterien besitzen keine Intronstrukturen. Ein Gen wird hier durch eine fortlaufende nicht unterbrochene Sequenz codiert. Bakterien "verstehen" die Intron-Information nicht. Sie haben auch keine Möglichkeit die unreife mRNA zu spleißen oder sonst zu bearbeiten.

Rückschluss: soll ein Gen aus dem menschlichen Erbgut in E. coli kloniert werden, so geht dies nur, wenn die Exon-Intron-Struktur zuvor entfernt wurde.

Vorgehen:

  • humanes Gen wird transkribiert
  • unreife mRNA enthält Exon und Intron
  • Spleißen
  • reife mRNA enthält nur noch codierende (Exon-)Sequenz
  • Rückübersetzen der mRNA in DNA mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase
  • Produkt: cDNA
  • cDNA kann kloniert werden
  • diese Sequenzinformation kann in Bakterien transkribiert und translatiert werden
  • das humane Protein kann in Bakterienzellen erzeugt werden

Beispiel: Herstellung von humanem Insulin

Insulin ist das Medikament zur Behandlung von Diabetes-Patienten.

Das Insulin wird durch rekombinante Proteinexpression in E. coli gewonnen. Das heißt E. coli stellt ein Protein her, das nicht zu seinem eigenem Genom gehört. Daher der Begriff "rekombinant".

Insulin besteht aus drei Peptiden, die gemeinsam das wirksame Insulin bilden. Das A-, B-, und C-Peptid sind auf unterschiedlichen Exonsequenzen codiert. Dabei muss nun berücksichtig werden dass Bakterien keine Intronsequenz ausschneiden können.

Die drei Peptide ordnen sich als Insulinstruktur an, Disulfidbrücken werden gebildet,dann wird das C-Peptid (posttranslational) aus dem Insulin ausgeschnitten. Erst dann ist das Peptidhormon funktionell!

Herstellung von Insulin in E. coli

1. Schritt:

cDNA der Insulin-Peptide erzeugen. Hier reichen uns die cDNA von Peptid A und B, da das C-Peptid im funktionellen Insulin nicht mehr vorkommt.

2. Schritt:

Klonieren der DNA-Sequenzen der A- und B-Peptide in E.coli (jeweils ein Vektor für ein Peptid).

3. Schritt:

Transformation von E. coli Bakterien mit den jeweiligen Vektoren (A- oder B-Vektor)

4. Schritt:

Expression von A- bzw. B-Peptid in den Bakterien

5. Schritt:

Lyse der Bakterien, aufreinigen der Peptide (separat)

6. Schritt

Mischen des A- und B-Peptid unter "Disulfid-Brücken-bildenden" Bedingungen. Insulineinheiten finden sich zum funktionellen Insulin zusammen!

Dieser Inhalt ist Bestandteil des Online-Kurses

Molekularbiologie / Genetik

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Diese Themen werden im Kurs behandelt:

[Bitte auf Kapitelüberschriften klicken, um Unterthemen anzuzeigen]

  • DNA als Erbsubstanz
    • Einleitung zu DNA als Erbsubstanz
    • Molekularbiologie als Thema im Abitur
    • Aufbau der DNA
      • Einleitung zu Aufbau der DNA
      • Einzelstränge der DNA
    • Experiment von Griffith (1928)
    • Mutationen
    • DNA- Replikation
      • Einleitung zu DNA- Replikation
      • historisches Experiment: Meselson und Strahl
    • Organisation der DNA
  • Vom Gen zum Protein
    • Einleitung zu Vom Gen zum Protein
    • Transkription
    • Translation
      • Einleitung zu Translation
      • Der genetische Code
      • Die Aufgaben der RNAs (mRNA, tRNA)
    • Proteinbiosynthese in Eukaryoten
    • Genwirkkette
      • Einleitung zu Genwirkkette
      • Genwirkkette am Beispiel Neurospora crassa
      • additive Polygenie
    • Regulation der Genexpression
      • Einleitung zu Regulation der Genexpression
      • Genregulation: molekularen Ebenen
      • Lac-Operon
      • Trp-Operon
      • Genexpression bei Eukaryoten
        • Einleitung zu Genexpression bei Eukaryoten
        • Epigenetik
          • Einleitung zu Epigenetik
          • DNA-Methylierung
        • Riesenchromosome machen Expression sichtbar
          • Einleitung zu Riesenchromosome machen Expression sichtbar
          • Entwicklungsstadien von Drosophila - regulierte Genexpression
  • Methoden der Gen- und Reproduktionstechnik
    • Einleitung zu Methoden der Gen- und Reproduktionstechnik
    • Klonierung
      • Einleitung zu Klonierung
      • Restriktionsenzyme
      • Methode: Gel-Elektrophorese
      • Klonierung von Fremd-DNA und Transformation
      • Transformation
      • cDNA
    • Methode: Polymerase-Ketten-Reaktion
    • Methode: genetischer Fingerabdruck
    • Methode: Gensonde
    • Methode: DNA-Microarray (Biochip)
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    • Bedeutung von Gentechnik in Biologie, Landwirtschaft und Medizin
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    • Einleitung zu Genetik der Zelle
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        • Einleitung zu Differentielle Genaktivität
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      • Stammzellen - wie weit darf die Forschung gehen?
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    • Einleitung zu Humangenetik
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    • Stammbaumanalysen
      • Einleitung zu Stammbaumanalysen
      • Heterozygotentest
      • Beispiele für Erbgänge und Stammbäume
    • Der Einfluß einer Mutation auf den Phänotyp - Beispiel einer Erbkrankheit
    • Pränataldiagnostik
    • Trisomie 21 - Beispiel einer Chromosomenmutation
    • Turner und Klinefelter - Beispiele für Fehlverteilungen der Gonosomen
    • Blutgruppen und Rhesusfaktoren
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