Aufklärung der Fotosynthese

Die Messung der Absorptionsspektren der einzelner Pigmente bzw. die Pigmentzusammensetzung der grünen Pflanzen gibt deutliche Hinweise auf das Wirkungsspektrum der Fotosynthese. Chlorophyll und Carotinoide sind die Hauptpigmente der Fotosynthese/Lichtreaktion. Man bezeichnet diese Methode Fotometrie.

Absorptionsspektren der Fotosynthesepigmente

Autoradiografie

Lichtreaktion

Durch Spaltung von radioaktiv markiertem Wasser (H₂¹⁸O) kann das radioaktive Sauerstoffisotop im abgegebenen Sauerstoff wiedergefunden werden. Dabei wird deutlich, dass der in der Fotosynthese erzeugte Sauerstoff aus Wasser stammt.

Dunkelreaktion

Melvin Calvin, Biochemiker und Aufklärer des nach ihm benannten Calvin-Zyklus, setzte ebenfalls die Autoradiografie in seiner Forschung ein.

So ist der Weg der CO₂-Fixierung nicht einfach nachvollziehbar. Calvin und Kollegen setzten das radioaktive Isotop ¹⁴C ein, um den Verbleib des Kohlenstoffs zu studieren. Dabei war folgende Annahme grundlegend:

¹⁴CO₂ ---> Produkt A ---> Produkt B ---> weitere Produkte ---> ^14?CH₂O (Kohlenhydrat/Glukose).                            

Melvin Calvin nutzte Chlorella, eine einzellige Alge, die einen großen Chloroplasten aufweist. So kann die CO₂-Zugabe über das Anzuchtgefäß erfolgen. Alkoholzugabe tötet Chlorella, sodass der Alkohol den Stoffwechselprozess sofort abschaltet.

Radioaktiv markiertes CO₂ wird eingesetzt. Dies ist ein CO₂, dessen Kohlenstoff durch das Isotop ¹⁴C ersetzt ist. Dieses CO₂ dient den Algen als ausschließliche Nahrung. Die Algen nehmen das markierte CO₂ auf und alle Produkte bis hin zum Zucker bzw. der Stärke sind mit dem ¹⁴C-Isotop markiert. Calvin experimenteller Ansatz:

• Starten der Fotosynthese
• Algen nehmen CO₂ auf
• Unterbrechung der Fotosynthese zu unterschiedlichen Zeitpunkten
• Ziel: Ablauf des Calvin-Zyklus herausfinden.

Calvin kombinierte die Technik der Autoradiografie mit der der Dünnschicht-Chromatografie.

Methode Dünnschicht-Chromatografie: Kleine, in Lösung vorliegende Substanzmengen können über Dünnschicht-Chromatografie aufgetrennt und dadurch charakterisiert werden. Das Prinzip der Dünnschicht-Chromatografie beruht auf einer stationäre Phase und einer mobilen Phase. Die stationäre Phase ist ein dünner Überzug auf einer Trägerplatte. Oft wird Aluminiumsilikat verwendet. Nun wird die Probe am unteren Ende dieser Platte aufgegeben. Die mit Aluminiumsilikat beschichtete Platte wird in ein Behältnis gestellt, dessen Boden mit einem Lösemittel, dem Laufmittel, bedeckt ist. Diese Flüssigkeit wird als mobile Phase bezeichnet. Das Laufmittel steigt langsam in der stationären Schicht auf. Das Probenmaterial wird je nach Löslichkeit in diesem Laufmittel unterschiedlich weit mitgetragen. Hat das Laufmittel die Oberkante der stationären Phase erreicht, wird die Platte aus dem Gefäß genommen und getrocknet. Bei gefärbten Substanzen kann die Laufstrecke direkt ausgemessen werden. Sind sie farblos, besprüht man die Platte zunächst mit einem spezifischen Reagenz oder betrachtet sie unter UV-Licht. Die Dünnschicht-Chromatografie kann auch mehrdimensional durchgeführt werden. Dazu werden der Probenauftrag und der „1. Lauf“ wie oben beschrieben durchgeführt. Um eine noch feinere Auftrennung der im Probenmaterial vorhandenen Substanzen zu erreichen, wird die stationäre Phase um 90° gedreht und in eine andere Lösemittelmischung gestellt. Calvin führte sein Experiment zur Dunkelreaktion ebenso durch.

Mithilfe der Autoradiografie werden auch geringste Mengen einer Substanz nachgewiesen. Zur Abbildung benutzt man Fotofilm, der an Stellen, die mit strahlenden Substanzen in Kontakt gekommen sind, belichtet wird. Diese enorm niedrige Nachweisgrenze bei Verwendung radioaktiver Isotope ist ein großer Vorteil der Methode.

Problem: die Folgen der Radioaktivität wie Krebsrisiko für den Experimentator und Entsorgung des strahlenden Materials …

Hier wird Melvin Calvins wichtiges Experiment nochmals in Bildern dargestellt:

Autoradiogramm einer 2-dimensionalen Papierchromatografie des von Calvin eingesetzten Chlorella-Extraktes.

Das Experiment wurde nach unterschiedlichen Zeiten gestoppt. So werden die Stoffwechselreaktionen nach a = 0,5 Sekunden, b = 5 Sekunden und c= 30 Sekunden unterbrochen und die radioaktiven Substanzen ausgewertet. 1, 2 = Zuckerphosphate; 3 = Glycerinsäurephosphat; 4 Triosephosphat; 5 Asparaginsäure; 6 = Malat; 7 = Saccharose; 8–11 = Aminosäuren wie z.B. Glycin, Serin oder Alanin; 12 = Glykolsäure.

Cornelis van Niel: Schwefelbakterien erklären die Fotosynthese

Van Niel untersuchte purpurfarbene Schwefelbakterien. Diese erzeugen Schwefel als Endprodukt der Fotosynthesereaktion. Statt H₂O wird das gasförmige H₂S als Edukt verwendet. Vergleicht man die Vorgänge dieser Fotosynthesevariante, so kann analog in Gleichungen die Herkunft des Sauerstoffs geklärt werden.

6 CO₂ + 12 H₂S -----> C₆H₁₂O₆ + 12 S + 6 H₂O

Analog in der Fotosynthese:

6 CO₂ + 12 H₂O ----> C₆H₁₂O₆ + 12 O₂ + 6 H₂O

Hill-Reaktion

Eine Suspension isolierter Chloroplasten kann verschiedene von außen zugeführte Moleküle reduzieren. Das heißt, die Lösung hat die Fähigkeit, Elektronen aufzunehmen! Ohne die Zugabe von CO₂ entstehthierbei Sauerstoff. Rückschluss: Der in der Fotosynthese entstehende Sauerstoff muss aus Wasser stammen.

Die Experimente von van Niel und Hill können jeweils unter Einsatz von radioaktiv markiertem CO₂ im Detail nachvollzogen werden.