Der Einfluß einer Mutation auf den Phänotyp - Beispiel einer Erbkrankheit

Die Sichelzellanämie (SZ) sei hier beispielhaft für eine Anwendung der Molekularbiologie vorgestellt. Diese PunktMutation ist mit molekularbiologischen Techniken einfach und schnell zu diagnostizieren. Zum Einsatz kommen DNA-Isolierung, PCR, Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese. Die SZ zeigt als autosomal rezessiv vererbte Krankheit, wie sich Genmutationen auf den Phänotyp auswirken können.

Molekularbiologische Analyse in Einzelschritten

DNA-Isolierung:

DNA lässt sich relativ einfach aus Zellen (z. B. Mundschleimhautzellen) isolieren. Dazu werden die Zellen mit Detergenz aufgeschlossen und Enzyme (DNAsen) und andere Proteine deaktiviert. In der Regel wird SDS (Natrium-Dodecylsulfat) als Detergenz eingesetzt.

Phenol-Chloroform extrahiert die zerstörten Proteine. Die DNA wird mithilfe einer Ethanolfällung aufkonzentriert und anschließend in wässriger Lösung aufgenommen. Die nun isolierte DNA bildet den Ausgangspunkt für die Detektion der Sichelzellanämie.

Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR):

Primer 5'- und 3'-seitig des Hämoglobingens (beta-Kette) werden ausgewählt. Die Primersequenz muss zu der DNA-Sequenz, an die sie binden soll, komplementär sein.

Die PCR wird auf der genomischen DNA durchgeführt. Es entsteht ein DNA-Fragment bestimmter Länge, z. B. 2.200 Basenpaare.

Mittels Agarose-Gelelektrophorese kann das Fragment analysiert werden. Das PCR-Fragment alleine gibt jedoch noch keine Auskunft über die vorhandenen Allele.

Es gibt drei mögliche Kombinationen der elterlichen Allele:

• homozygot für Hämoglobin A
• homozygot für Hämoglobin S
• heterozygot: jeweils ein Allel der Variante Hämoglobin A und Hämoglobin S

Restriktionsverdau:

Die Proteine von Hämoglobin A und Hämoglobin S unterscheiden sich lediglich in einer einzelnen Aminosäure und auch auf der Genebene liegt die Abweichung in nur einer ausgetauschten Base. Zur Bestimmung dieser Punktmutation dient ein Restriktionsenzym. Dabei gilt es, ein solches Restriktionsenzym zu wählen, dessen spezifische Erkennungssequenz den bei der Erbkrankheit relevanten Bereich umfasst. MstII erkennt und schneidet DNA exakt im Bereich des Codons für die Aminosäure #6. Hier kommt es zur Veränderung des Nukleotids im Sichelzellhämoglobingen.

Agarose-Gelelektrophorese:

In der Agarose-Gelelektrophorese werden die im Restriktionsverdau entstandenen DNA-Fragmente im elektrischen Feld aufgetrennt. Dabei werden folgende, in den Abbildungen gezeigte Kombinationen sichtbar:

Agarose-Gelelektrophorese einer Restriktionsanalyse des Hämoglobin A- bzw. Hämoglobin S-Gens mit MstII.

In der ersten bzw. letzten Spur auf den Gelen ist jeweils ein Längenstandard zu sehen, der als interner Marker verwendet wird. In diesem Experiment wurde der GeneRuler 100 bp von Fermentas eingesetzt.

Die molekularbiologische Analyse ermöglicht es, in sehr kurzer Zeit (wenige Stunden) die Frage zu klären, ob eine Person Träger für Sichelzellanämie ist oder nicht. Zudem vermag es die Analyse, Homozygote für HbA oder HbS eindeutig zu zeigen.

Als Genotyp wird die genetische Zusammensetzung eines Organismus bezeichnet.

Im Falle der Sichelzellanämie handelt es sich um eine rezessiv vererbte Krankheit. Das heißt, nur wenn beide Allele für das Hämoglobingen (Beta-Kette) in veränderter Form vorliegen, kommt die Krankheit auch phänotypisch zum Vorschein.

Der Phänotyp umfasst all diejenigen Merkmale, die ein Individuum nach außen hin charakterisieren. In der Regel ist der Phänotyp eines Patienten, also sein Erscheinungsbild, auch das, was der Arzt zunächst beurteilt, bevor er Blut- oder auch DNA-Untersuchungen daran anknüpft.

Genotyp -> Phänotyp

• → rezessiv
• Genotyp AA: nur nicht betroffene Allele = gesund
• Genotyp Aa: Mischung aus betroffenem und nicht betroffenem Allel = gesund
• Genotyp aa: nur betroffene Allele = Ausprägung des Krankheitsmerkmals**

** Vererbungstechnisch entspricht die SZ dem Dominant-Rezessiv-Schema, auf molekularer Ebene hingegen einer ko-dominanten Ausprägung der Genprodukte.

Sichelzellanämie:
Diese Erbkrankheit wird autosomal rezessiv vererbt, d. h., in der F1 findet sich die phänotypische Verteilung des beobachteten Merkmals im Verhältnis 3:1. Die gewählte Abbildung zeigt eine andere Nomenklatur als die gewohnten Klein- und Großbuchstaben. Dies liegt an der Verwendung beider Allele (verändertes Gen und nicht verändertes Gen des Hämoglobinproteins) auf molekularer Ebene. So findet sich in der Literatur meist A für das unveränderte Hämoglobin A (beta-Kette) und S für das Sichelzell-Hämoglobin.

In der ersten bzw. letzten Spur auf den Gelen ist jeweils ein Längenstandard zu sehen, der als interner Marker verwendet wird. In diesem Experiment wurde der 100 bp GeneRuler von Fermentas eingesetzt.

Die molekularbiologische Analyse ermöglicht in nur sehr kurzer Zeit (wenige Stunden) die Frage zu klären, ob eine Person Träger für Sichelzellanämie ist. Gleichfalls zeigt die Analyse homozygote für HbA oder HbS eindeutig.

Vom Genotyp zu Phänotyp

Im Falle der Sichelzellanämie handelt es sich um eine rezessive Erbkrankheit. Das heisst, nur wenn beide Allele für das Hämoglobin-Gen (Beta-Kette) in veränderter Form vorliegen, kommt die Krankheit auch phänotypisch zum Vorschein.

Der Phänotyp ist alles was ein Individuum nach außen hin charakterisiert. In der Regel ist der Phänotyp auch das was z.B. von einem Arzt zuerst beschrieben wird, bevor Blut- oder auch DNA-Untersuchungen durchgeführt werden.

Phänotyp <=> Genotyp

• -> rezessiv
• Genotyp AA: nur  nicht betroffene Allele = gesund
• Genotyp Aa: Mischung aus betroffenem und nicht betroffenem Alles = gesund
• Genotyp aa: nur betroffene Allele = Ausprägung Krankheitsmerkmal**

**Sichelzellanämie (SZ): Vererbungstechnisch entspricht die SZ dem dominant-rezessiv-Schema, auf molekularer Ebene hingegen einer ko-dominanten Ausprägung der Genprodukte.

Vererbung Sichelzellanämie, autosomal rezessiv