Klonierung von Fremd-DNA und Transformation

Eine Klonierung ist die Einführung eines DNA-Fragments (Insert) in einen Vektor (oder Plasmid).

Schema einer Klonierung. Insert und Vektor müssen Restriktionsverdau, Dephosphorylierung und Ligation erfolgreich überstehen um ein neues Insert-Vektor-Konstrukt zu bilden.

Vektor oder Plasmid: zirkuläre extrachromosomale DNA, in der Regel in Bakterien zu finden, aber auch für Eukaryoten (z. B. Hefen) verfügbar. Der Vektor oder das Plasmid kann im Klonierungsprozess DNA eines anderen Lebewesens aufnehmen. Der Vektor ermöglicht eine Vermehrung des DNA-Fragments innerhalb von Bakterienzellen, die mit diesem Vektor transformiert wurden.

Die Klonierung ist nicht zu verwechseln mit dem „Klonen“, dem Herstellen einer identischen Kopie eines vorhandenen Lebewesens.

Voraussetzung für die Durchführung einer Klonierung sind ein Vektor sowie das gewünschte DNA-Fragment, mit dem gearbeitet werden soll.

Wie ist ein Vektor aufgebaut?

Die obige Abbildung zeigt den Vektor als zirkuläres DNA-Molekül. Innerhalb des Vektors befinden sich wichtige Sequenzen, die für die Klonierung eines DNA-Fragments notwendig oder hilfreich sind.

1. ORI = origin of replication oder Replikationsursprung
2. Der Replikationsursprung ist notwendig, um den Vektor innerhalb von Bakterienzellen zu vermehren. Die zirkuläre Vektor-DNA wird an einer Stelle (am ORI) geöffnet, hier beginnt die Replikation (bitte vergleichen Sie nochmals die Informationen zum Prozess der Replikation im entsprechenden Lernkapitel)
3. MCS = multiple cloning site oder Polylinker
4. Sequenzabfolge im Vektor, die Erkennungsstellen für bestimmt Restriktionsenzyme enthält. Diese Sequenzen kommen nur in der MCS, nicht aber in der übrigen Vektor-Sequenz vor.
5. Gen für eine oder mehrere Antibiotikaresistenzen
6. Die genetische Information für eine bestimmte Antibiotikaresistenz ist ein wichtiger Marker im Klonierungsprozess. Nur Bakterienzellen, die Vektor-DNA erhalten haben, können auf Nährmedien mit Antibiotikazusatz wachsen!
7. Alle momentan im molekularbiologischen Labor verwendeten Vektoren sind aus drei natürlich vorkommenden Vektoren entwickelt worden. Dabei wurde z. B. darauf geachtet, dass diese Vektoren nicht mehr zur Konjugation befähig sind. Vektoren, die im Labor zur Klonierung von Fremd-DNA eingesetzt werden, haben die Fähigkeit, sich eigenständig von Zelle zu Zelle auszutauschen bzw. sich dadurch zu verbreiten, verloren!

Wahl des Vektors

Entscheidet sich nach dem Grund für die Klonierung:

• Soll DNA-Material vermehrt werden?
• Soll Protein exprimiert werden?
• Welche Schnittstellen liegen in der multiple cloning site?
• Welche Antibiotikaresistenz liegt auf dem Plasmid?
• Welcher origin of replication (ORI) ist vorhanden?

Vorbereiten des Inserts

Wo kommt das Insert (DNA-Fragment) her?

• erhalten in der Regel über PCR direkt aus Herkunftsorganismus (Beispiel: Hefegen wird mittels PCR auf genomischer Hefe-DNA vervielfältigt)
• oder durch Subklonierung aus anderem Vektor-Insert-Konstrukt

Was muss beachtet werden?

• Eingeführte Restriktionsschnittstellen müssen zu gewähltem Vektor passen.
• Gewählte Restriktionsenzyme dürfen NICHT im Insert schneiden!
• Wenn möglich sollten Restriktionsenzyme gewählt werden, die sogenannte klebrige Überhänge („sticky ends“) produzieren.

Verbinden Vektor – Insert

Um das DNA-Fragment (Insert) mit dem Vektor zu verbinden, wird eine Ligation durchgeführt. Hierbei verbindet das Enzym DNA-Ligase die passenden Überhänge, indem sie die 3’-Hydroxylenden mit den 5’-Phosphatenden verestert.

Die DNA-Ligase kennen Sie bereits von der DNA-Replikation. Auch in diesem Prozess verbindet die DNA-Ligase das 3’-Hydroxylenden mit den 5’-Phosphatende durch Erzeugung einer Esterbindung.

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