Methode: Gel-Elektrophorese
DNA lässt sich in einer geeigneten Gelmatrix (Agarose) durch Anlegen einer Spannung umgekehrt proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichtes auftrennen. So kann z. B. überprüft werden, ob ein Restriktionsverdau erfolgreich durchgeführt werden konnte.
Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine Methode zur Auftrennung von DNA. Die DNA-Fragmente werden nach ihrer Größe in der Gelmatrix getrennt.
Prinzip der Gelelektrophorese
Das Prinzip: Man löst Agarose in Elektrophoresepuffer. Dies funktioniert nur unter Erhitzen (z. B. in der Mikrowelle). Daraus gießt man ein Agarosegel, in dem Taschen für den Probenauftrag ausgespart werden.
Die feste Agarose besitzt eine netzähnliche Struktur mit gleichmäßigen molekularen Hohlräumen („Molekularsieb“). Je nach Konzentration der Agarose sind diese Hohlräume unterschiedlich groß. Die negativ geladenen DNA-Moleküle wandern abhängig von ihrer Größe mit konstanter Geschwindigkeit zur Anode (+). Größere Moleküle werden durch die Poren der Netzstruktur abgebremst und wandern dadurch langsamer im elektrischen Feld als kleinere Moleküle.
Merke
DNA trägt eine negative Ladung.
Gellauf
DNA hat die ungünstige Eigenschaft, dass sie für unser Auge nicht zu erkennen ist. Farblose Lösungen und unsichtbare Fragmente sind die Folge.
Abhilfe schaffen der Ladepuffer (Bromphenolblau als Farbstoff, um die Lauffront anzuzeigen, damit die DNA-Moleküle nicht aus dem Gel herauswandern) und Ethidiumbromid (EtBr, karzinogen!). Das Ethidiumbromid lagert sich in die Doppelhelixstruktur der DNA ein (es „interkaliert“ in den aromatischen Ringsystemen der Nukleotide) und leuchtet bei Anregung durch UV-Licht orange.
Agarosegel in Elektrophoresekammer. Die mit Ladepuffer versetzten Proben laufen im elektrischen Feld in die Gelmatrix ein. Bromphenolblau bildet dabei eine für das Auge sichtbare Lauffront. Rechts: Foto desselben Gels nach dem Gellauf. Die DNA wird mit Ethidiumbromid und UV-Licht sichtbar gemacht.
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